A Biblioteca divide-se em dois núcleos específicos: a Biblioteca D. Manuel II e o Fundo Geral, possui ainda hemeroteca, coleções de cartografia, gravura e medalhística. Os termos e condições da acesso ao Serviço de Leitura estão fixados em Regulamento.

O Rei começara a recolher, em 1920, monografias e documentação para escrever a história do reinado do Rei seu homónimo do século XVI, procurando trazer nova luz sobre o problema da expulsão dos judeus. Ao prosseguir esse projeto foi reunindo obras quinhentistas e surgiu-lhe mais tarde a ideia de fazer uma coleção de livros antigos Portugueses (séculos XV e XVI). Esse propósito tomou uma tal amplitude que culminou numa das melhores coleções de impressos Portugueses do século XVI, pode dizer-se que este acervo só tem paralelo em número com a Biblioteca Nacional de Portugal ou a Biblioteca Pública de Évora.

Em 1929 saiu o primeiro volume do catálogo, em edição bilingue português e inglês, de “Livros Antigos Portugueses…” seguido pelo volume segundo em 1932. D. Manuel morre nesse ano e, portanto, o terceiro volume será feito pela sua secretária Margery Withers. Os dois primeiros são incomparáveis pela iconografia que apresentam e pelo estudo das obras que o Rei ia adquirindo e investigando.

A qualidade e a erudição do trabalho de D. Manuel II coloca-o nos primeiros lugares da nossa história do livro, só comparável a Barbosa Machado ou a António Joaquim Anselmo. Para destacarmos alguns exemplares podemos falar de “Vita Christi” 1495, das “Ordenações Manuelinas” de 1514, das obras de Pedro Nunes desde 1537, das obras de Damião de Góis desde 1543, das obras de João de Barros, André de Resende, D. Jerónimo Osório, Frei Heitor Pinto, etc.

A biblioteca de Rei incluía manuscritos como “De bello Septensi (…)” de Mateus de Pisano ou o “Livro das plantas das fortalezas, cidades e povoações do Estado da India Oriental”. 

Merece particular destaque a Camoniana, por ser talvez a mais completa de edições quinhentistas e incluir todas as sucessivas edições nacionais e estrangeiras até 1800. Infelizmente o Rei não sobreviveu para fazer o seu estudo no terceiro volume onde constam essas obras.

As espécies adquiridas são também do melhor quilate: pode falar-se em “Constituições do Bispado do Porto” de 1497, primeiro incunábulo de um impressor português; “História…do Descobrimento e Conquista da Índia”, Fernão Lopes de Castanheda; “A Crónica do Condestável” primeira edição de 1526, obra atribuída a Fernão Lopes; várias obras de Frei Luis de Granada e de Frei Heitor Pinto.

Entre os manuscritos destacamos o “Livro de Menagens” a D. Manuel I e o “Livro de Sentenças para D. Sebastião”, iluminado por António de Holanda, a Carta de Patrício Romano dada ao Bispo D. José Maria da Fonseca, uma Bíblia em pergaminho do século XIII, um livro de Horas em pergaminho do século XVI e vários forais Manuelinos.”